凝膠色譜柱是一種常用的分離技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、生物化學(xué)、藥學(xué)、食品科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測等多個領(lǐng)域。通過凝膠顆粒來實(shí)現(xiàn)樣品分離。凝膠顆粒根據(jù)其物理化學(xué)性質(zhì)選擇性地固定不同的化合物，從而實(shí)現(xiàn)樣品的分離和純化。其分離機(jī)理主要包括凝膠顆粒的吸附和分子篩效應(yīng)。凝膠顆粒表面的功能基團(tuán)能夠與化合物發(fā)生作用，形成化學(xué)鍵，使其被固定在凝膠上。當(dāng)樣品通過凝膠色譜柱時，分子會根據(jù)其不同的分子大小、電荷、親疏水性等物理化學(xué)性質(zhì)在凝膠顆粒表面逗留時間不同，從而實(shí)現(xiàn)分離和純化。

　　凝膠色譜柱的使用涉及多個關(guān)鍵步驟和注意事項，以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。以下是一些使用凝膠色譜柱的技巧：

　　1、凝膠的選擇

　　根據(jù)樣品性質(zhì)選擇：如果分離的是水溶性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等大分子，一般選擇Sephadex G系列或Bio-Gel P系列等親水的凝膠；如果是分離有機(jī)溶劑中的有機(jī)物，則選擇適合有機(jī)溶劑的凝膠，如交聯(lián)聚苯乙烯凝膠用于凝膠滲透色譜（GPC）。

　　考慮分子量范圍：不同的凝膠有不同的排阻極限和分級范圍。例如，Sephadex G-25適合分離分子量小于5000的小分子物質(zhì)，而Sephadex G-200則可用于分離分子量較大的物質(zhì)。要根據(jù)待分離樣品的分子量大小來選擇合適的凝膠型號。

　　2、凝膠柱的制備

　　溶脹處理：商品凝膠通常是干燥的顆粒，使用前需要將其在洗脫液中充分溶脹。一般在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近沸，可以縮短溶脹時間至1-2小時。溶脹一定要完q，否則會導(dǎo)致色譜柱不均勻。

　　裝柱方法：裝柱時要確保凝膠填充均勻?？梢韵仍谥鶅?nèi)裝入約1/3高度的水或緩沖液，然后將溶脹好的凝膠在攪拌成稀漿的情況下慢慢倒入柱內(nèi)，使其自然沉降，如此連續(xù)操作，得到均勻的柱床。也可以采用水浮選法去除凝膠中的單體、粉末及雜質(zhì)，并用真空泵抽氣排出凝膠中的氣泡。

　　柱均勻性檢查：裝填好凝膠柱后，需要進(jìn)行均勻性檢查。可以在柱旁放一平行的日光燈，用肉眼觀察柱內(nèi)是否有“紋路”或氣泡；也可以向色譜柱內(nèi)加入有色大分子等，如果觀察到柱內(nèi)譜帶窄、均勻、平整，說明色譜柱性能良好；如果色帶出現(xiàn)不規(guī)則、雜亂、很寬時，需要重新裝填凝膠柱。

　　3、加樣技巧

　　樣品處理：樣品應(yīng)先經(jīng)過過濾或離心，去除其中的固體顆粒，以免污染色譜柱。對于高濃度樣品，應(yīng)進(jìn)行稀釋后再進(jìn)樣，以降低背景干擾。同時，要注意控制樣品的體積，一般不超過色譜柱床體積的1%-5%。

　　上樣方式：上樣時要將樣品緩慢地沿著柱壁加入到凝膠柱的表面，避免破壞凝膠表面?？梢允褂瞄L嘴滴管或微量注射器進(jìn)行上樣，使樣品能夠均勻地分布在凝膠表面。

　　4、洗脫與檢測

　　洗脫劑選擇：洗脫劑的選擇要根據(jù)樣品的性質(zhì)和凝膠的類型來確定。一般來說，要選擇與樣品和凝膠都相適應(yīng)的洗脫劑，既能有效地洗脫樣品，又不會對凝膠造成損害。同時，洗脫劑的流速也要適當(dāng)，過快會導(dǎo)致分離效果不佳，過慢則會延長分析時間。

　　檢測方法：常用的檢測方法有紫外檢測、示差折光檢測等。在使用檢測器時，要根據(jù)樣品的性質(zhì)和檢測要求選擇合適的檢測波長和檢測參數(shù)，以提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。

　　5、色譜柱的維護(hù)與保養(yǎng)

　　防止微生物生長：對于長時間使用的凝膠柱，要防止微生物的生長?？梢栽谙疵搫┲屑尤脒m量的防腐劑，如疊氮鈉等，或者定期用適當(dāng)?shù)南緞_洗色譜柱。

　　避免壓力沖擊：在使用過程中要避免色譜柱受到壓力的沖擊，如突然升高或降低壓力可能會導(dǎo)致凝膠床的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響分離效果。因此，在使用泵時要設(shè)置合適的壓力和流量，并且在操作過程中要避免色譜柱的堵塞。

　　定期清洗：每次使用完色譜柱后，要及時進(jìn)行清洗。先用對被測樣品洗脫能力強(qiáng)的溶劑將吸附在柱內(nèi)的樣品洗脫下來，然后再用適當(dāng)?shù)娜軇_洗色譜柱，以去除殘留的樣品和雜質(zhì)。